E.coli+M15碱性磷酸酶的表达、纯化及活性分析

目的:克隆、表达并纯化大肠杆菌M15碱性磷酸酶(EAP)成熟肽(phoA),分析其活性。方法:采用PCR技术从M15基 因组DNA中扩增出phoA编码基因;构建其原核表达载体pCold—TF—EAP;转入E洲f BL21(DE3)进行表达;IMAc Ni—NTA柱 层析法纯化重组蛋白;重组蛋白与底物对硝基苯磷酸二钠显色反应分析其活性。结果:克隆得到了序列约1 400 bp phoA编码基 因,原核表达了分子量约为100 kDa的融合重组EAP(rEAP),纯化获得的rEAP具有催化磷酸单酯的活性,有效反应温度范围大, 在27°C一67°C都具有较高的催化活性,在pH 7.5—8.0间催化活性最高。